4-4. Ⅱ型制限酵素のDNA認識配列と切断末端

https://gyazo.com/c46126ed3d416a19ff66aa9dd02da825

1) 認識配列と切断部位

制限酵素は二本鎖DNA中の4~8個の塩基(連続する場合と、間に任意の塩基が入る場合がある)を認識してDNAに結合し、その部位にあるリン酸ジエステル結合を両鎖で切断(加水分解)する

酵素によっては認識部位から少し離れた所を切断するものもある

制限酵素はDNAを切断するハサミのようなもの

https://gyazo.com/e3eb9bd1096feb751a3b4e94bfd1db9b

4塩基認識酵素

マッチする塩基配列の存在頻度が高い→DNAを細かく裁断(平均256塩基に1回)

8塩基認識酵素

頻度が低い→DNAを大まかに裁断(平均65,536塩基に1回)

ゲノム解析や大きなDNA断片を得るのに適している

認識配列はパリンドローム配列(回分配列)を含むことが多い

e.g. Hpa Iのの認識配列5'-GTTAACの相補鎖も、5'-GTTAAC

制限酵素の認識部位の塩基数

4塩基

5塩基

6塩基

8塩基

2) 粘着末端と平滑末端

他のDNA分解酵素と異なり、制限酵素は切断する末端(切断面)の形状に特徴がある

ある種の酵素は二本鎖DNAをまっすぐ横断するように切断する

多くの酵素は1~6塩基ずらして二本鎖を切断し、一本鎖の突出した末端を生ずる

突出末端はDNAを同士を付着させることができるため、粘着末端ともよばれる

https://gyazo.com/2b56237b0b841d82d2acfe90c0d6a3b4

3) 切断地図

DNAをの塩基配列がわかるまでは、あるDNAが他と同じかどうかを判断する重要な手がかりだった

4) 制限酵素の反応性とスター活性

制限酵素はDNA内部の決まった部位を切断するので制限エンドヌクレアーゼともいい、他のDNA分解酵素と同じように金属イオン(通常は$ \mathrm{Mg^{2+}})要求性

切断末端は5'-P(P=リン酸基), 3'-OHで、都合位のよいことに、そのままでDNAリガーゼ反応に使用できる

酵素によって反応条件、特に至適塩濃度が大きく異なる場合があり、複数の酵素を同時に反応させる場合には注意を要する

制限酵素は、反応条件が整わないと配列認識の厳格性が低くなり、本来の認識部位以外でも切断してしまう

スター活性が出る原因としては、高濃度グリセロール、マグネシウムイオン($ \mathrm{Mg^{2+}})以外の金属イオン、DMSOなどの有機溶媒、低イオン強度、高pHなどがある

table: 表4−3 スター活性の例(Y: C or T, M: A or C, R: G or A, K: G or T, N: A or G or C or T, \で切断)

制限酵素の名称正規の認識配列スター活性によって認識される配列

BamH I G\GATCC GRATCC / GGANCC / GGNTCC / GGATYC

EcoR V GAT\ATC RATATC / GATNTC / GNTATC / GANATC / GANATC / GATATY

Hind III A\AGCTT RAGCTT / AAGMTT / ANGCTT / AAGCNT / AAKCTT / AAGCTY